INTRODUCCION
LBIODEGRADACION DE AMINAS BIOGENICAS.
1.1.Aminas biogénicas. Aspectos generales
1.2.Aminas biogénicas como neurotransmisores.
1.3.Presencia de aminas biogénicas en los alimentos.
- Presencia de aminas en alimentos no fermentados
- Presencia de ominas en alimentos fermentados.
1.4.Toxicología de las aminas biogénicas.
1.5.Producción de aminas biogénicas.
1.5.1 Descarboxilación aminoácidos Q.
-1.5.2.Microorganismos productores de oaminas biogénicas.
1.6.Mét0dos analiticos aplicados 21 la valoracién dé la capacidad de producción de aminas por parte de los microorganismos: Detección y cuantificación
1.6.1.Métodos para detectar microorganismos con capacidad aminobiogénica
1.6.2. Métodos analíticos para detectar animas en alimentos
1.7.Degradación de aminas biogénicas
1.7.1.Quinoproteinas amino oxidasas.
1.7.2. Quinohemoproteínas amino deshidrogénasas.
1.7.3. Quinohemoproteínas amino deshidrogénasas
1.7.4. Desaminación de tiramina
OBJETIVOS
MATERIALES Y METODOS.
MICROORGANISMOS UTILIZADOS
2.VECTORES UTILIZADOS.
3.MEDIOS DE CULTIVO
4.MANTENIMIENTO Y CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
5.ADITIVOS SUPLEMENTADOS ALOS MEDIOS DE CULTIVO.
6.METODOS GENERALES PARA EL ANALISIS Y/O TRATAMIENTO DE LAS
MUESTRAS DE DNA.
6.1.Aislamiento de DNA genómico de Pseudomonas putida
6.2.Aislamiento de DNA plasmídico de Lactocococcus.
7. TRANSFORMACION DE LACOTOCOCCUS LACTIS.
8. ANALISIS DE LAS SECUENCIAS DE DNA.
9. OBTENCION DE CEPAS MUTANTES DE P. PUTIDA.
9.1. Mutagénesis con el transposón Tn5.
9.1.1. Identificación del punto de inserción del transposón Tn5 en el DNA genómico
9.1.2. Identificación del punto de inserción del transposón Tn5 en el DNA genómico mediante la estrategia de ?recombinación en el brazo del Tn5?.
9.1.3. Secuenciación de las zonas adyacentes a un fragmento de secuencia conocida.
9.2. Disrupción genética mediante recombinación de un fragmento homólogo
9.3. Obtención·de mutantes mediante deleción
10. ANALISIS DE LOS CALDOS IDE CULTIVO MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
11. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD 4-HIDROXIFENILACETATO 3-HIDROXILÁSICA
RESULTADOS Y DISCUSION
1. AISLAMIENTO DE- MUTANTES INCAPACES DE DEGRADAR TIRAMINA.
2. ANALISIS MEDIANTE 5 HPLC DE LOS METABOLITOS ACUMULADOS EN LOS CALDOS DE CULTIVO POR LOS DISTINTOS MUTANTES.
3. IDENTIFICACION DEL PUNTO DE INSERCION DEL TRANSPOSON TN5 Y SECUENCIACION DE LAS ZONAS ADYACENTES
3.1. Identificación del punto de inserción del transposón Tn5 en el DNA genómico mediante la estrategia de "recombinación en el brazo del Tn5"
4. ANALISIS DE LOS DIFERENTES CLUSTERS IMPLICADOS EN
LADEGRADACION DE TIRAMINA Y DE ACIDO 4-OH-FENILACETICO EN P.PUTIDA U.
4.1.Ruta catabólica de degradación de tiramina.
4.1.1 Organización genética del cluster tyn.
4.1.1.1.Desamil1aci6n de la tirzuijina.
- Gen tynA
- Gen tynB
- Gen tynC
4.1.1.2. Oxidación de1 4-hidroxifenilacetaldehódo.
- Gen tynC
- ORF 2
4.1.1.3. Regulación de la ruta tyn de Conversión de la- tiramina; en 4-OH-PhAc
- Gen tynC
4.1.1.4. Otros ORFs presentes en el cluster tyn.
- ORF 1.
- ORF 3.
4.1.2.Análisis comparativo de otros posibles cluster tyn presentes en diferentes microorganismos.
4.2. Ruta catabólica de degradación dé ácido 4-OH-fenilacético.
4.2.1. Organización genética del cluster hpa en P. putida U.
4.2.1.1. Hidroxi1ación del 4-OH-PhAc
- Operon hpaBC.
4.2.1.2. Etapa responsable de. la apertura en meta del anillo aromático del 3,4-diOH-PhAc.
- Gén hpaD
4.2.1.3. Continuación de la ruta meta de degradación del 3,4-diOH-PhAc
- Gen hpaE
- Gen hpaF
- Gen hpaG
- Gen·hpaH
- Gen hpaI
4.2.1.4. Transporte del 4-OH-PhAc
- Gen hpaX
4.2.1.5. Regulación de la ruta de degradación de1 3,4-diOH-PhAc
- Gen hpaE
- Gen hpaR
- Gen tetR
4.2.2. Análisis comparativo del cluster hpa en otros· microorganismos.
5. ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN DE LOS CLUSTER TYN Y HPA DE P. PUTIDA U.
6. SECUENCIA DE LOS CLUSTER TYN Y HPA- DE P. PUTIDA U.
7. EXPRESIÓN HETERQLOGA DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA DEGRADACIÓN DE TIRAMINA Y DE 4-OH-PHAC EN P. PUTIDA U
- Wpk-TBamHI
- WpK-TE y WpK-TE-B
- WpK-Tyr
- WpK-Tyr-6
- WpK-Tyr-2
- WpK-Tyr4
- KT2440pK-TyrOH
8. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DEL CLUSTER TYN PARA DESAMINAR OTRAS AMINAS AROMATICAS.
- 2-feniletilamina
- Octopamina
- Triptamina e Histamina
- Dopamina
9. DERIVACION DE LA RUTA METABOLICA DE LA TIROSINA A TRAVES DE LA RUTA DE DEGRADACION DE TIRAMTNA Y 4-OHPHAC EN P. PUTIDA U.
10. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.
El objeto de esta Tesis doctoral ha sido la identificación y caracterización de los genes responsables de la degradación de tiramina y de ácido 4-OH-fenilacético, así como de las proteínas codificadas en ellos. La tiramina es una importante amina biogénica que cuando se acumula en el organismo puede desencadenar importantes efectos tóxicos. En resumen, las conclusiones más importantes de este trabajo se muestran a continuación.
1.- El metabolismo aeróbico de la tiramina en P. putida U tiene lugar mediante una ruta específica e independiente de la descrita para PhEtNH2..
2.- La tiramina es degradada en P. putida U mediante una serie de pasos metabólicos que conducen a su transformación en 4-OH-PhAc, y, posteriormente, en 3,4diOH-PhAc. Este intermediario dihidroxilado sufrirá la apertura del anillo aromático permitiendo su posterior transformación en intermediarios generales.
P. putida3.- Se han identificado y caracterizado los genes que codifican las funciones necesarias para la degradación de tiramina y de 4-OH-PhAc en Putida U. Estos genes (22) están incluidos en un segmento de DNA de 25 Kb y agrupados en dos clusters catabólicos (tyn y hpa) consecutivos.
4.- El cluster tyn es el responsable de la degradación de tiramina a 4-OH-PhAc y está constituido por 8 genes que se extienden a lo largo de un fragmento de DNA de 12 kb. Entre las proteínas codificadas por esta agrupación genética se encuentran: una tiramina oxidasa dependiente de FAD (TynAB); una 4-OH-fenilacetaldehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ (TynC); una aminooxidasa (tynD) que participa en el proceso de desaminación de la tiramina cuando la bacteria se cultiva a 37 ºC y una proteína reguladora (TynR) que actúa como activador de la expresión de las proteínas TynAB y TynC. Además, en este cluster tyn se han identificado otros ORFs que pudieran estar implicados en la degradación de tiramina pero cuya participación no parece ser imprescindible para que se lleve a cabo dicho proceso. Estos son los ORF1 y ORF3 que codifican sendas proteínas transportadoras y el ORF2 que codifica una proteína cuya función no ha sido asignada hasta el momento, pero que pudiera actuar acoplada a la reacción de oxidación del 4-OH-fenilacetaldehído ejerciendo una función de transferencia de electrones.
5.- El cluster hpa es el responsable de la degradación del 4-OH-PhAc hasta intermediarios del metabolismo general (ácido pirúvico y semialdehído succínico), y está constituido por 14 genes que se hallan en un fragmento de DNA de 13 Kb. Estos genes codifican las siguientes proteínas catabólicas: una 4-OH-PhAc monooxigenasa (HpaBC); una dioxigenasa responsable de la apertura del anillo aromático del ácido homoprotocatéquico (HpaD); una deshidrogenasa (HpaE); una isomerasa (HpaF); una descarboxilasa (HpaG1G2); una hidratasa (HpaH) y una aldolasa (HpaI). En el cluster hpa los genes reguladores están constituidos por dos copias del gen hpaR (que codifica una proteína que actúa como represor de los genes catabólicos hpaG1G2EDFHI), el gen hpaA que codifica el activador transcripcional del operón hpaBC y un gen regulador, tetR, de función desconocida. En P. putida U existe además, un transportador específico, codificado por un gen (hpaX) integrante del cluster hpa, responsable del transporte del 4-OH-PhAc al interior de la célula, que mejora sustancialmente la eficiencia del transporte de este compuesto frente a la obtenida mediante fenómenos de difusión pasiva.
7.- Las rutas catabólicas tyn y hpa responsables de la degradación de tiramina y 4-OH-PhAc en P. putida U también son capaces de reconocer la dopamina y llevar a cabo su degradación a través del 3,4diOH-PhAc hasta ácido pirúvico y semialdehído succínico. En cambio, este sistema enzimático no es capaz de degradar otras aminas tales como PhEtNH2, octopamina, histamina o triptamina.
8.- Se ha logrado clonar y expresar conjuntamente en un plásmido (pK18::mob), los clusters tyn y hpa, dotando de este modo a las cepas transformadas con esta construcción de la capacidad necesaria para metabolizar tanto la tiramina como el 4-OH-PhAc.
9.- Se ha conseguido establecer, mediante la clonación de una tirosina descarboxilasa de Lactococcus lactis IPLA 655, una nueva ruta catabólica para L-tirosina en P. putida U que cuenta con el 3,4diOH-PhAc como metabolito intermediario y que supone una alternativa a la existente en este microorganismo.
10- Los resultados obtenidos nos permiten definir al 3,4diOH-PhAc como una molécula central en la que convergen las rutas periféricas implicadas en el catabolismo de diferentes compuestos, integrando una unidad catabólica compleja (catabolón). Estas rutas periféricas pueden ser tanto propias de la especie en consideración, como es el caso de las rutas de degradación de tiramina, 4-OH-PhAc y dopamina en P. putida U, como aquellas que son adquiridas heterólogamente, como lo es el caso de la nueva ruta de degradación de tirosina en este mismo organismo.
